Juan Diego Botto nació en Buenos Aires, Argentina, el 29 de agosto de 1975; y se fue a vivir a España, junto a su mamá y su hermana, luego de que su padre, también actor, fuese uno de los treinta mil desaparecidos de la dictadura militar argentina (1976-1983).
Una vez en tierra española Juan Diego estudió interpretación en la escuela donde su madre daba clases. Más tarde se fue a Nueva York, para continuar sus estudios bajo la dirección de Uta Hagen. A los cinco años hizo su primera aparición en cine, en la película "Juego de poder", de Fausto Canel (1983).
Los filmes que le valieron la popularidad fueron "Martín (Hache)" (1997) y "Roma" (2004). También actuó en los siguientes filmes:
"Teo el pelirrojo" (1985)
"Los motivos de Berta: Fantasía de pubertad" (1985)
"El río de oro" (1986)
"Hace quince años" (1987)
"Si te dicen que caí" (1989)
"Ovejas negras" (1990)
"Cómo ser mujer y no morir en el intento" (1991)
"1492: La conquista del paraíso" (1992)
"Mascara de Dijon" (1993)
"Historias del Kronen" (1995)
"La sal de la vida" (1996)
"Éxtasis" (1996)
"La Celestina" (1996)
"Más que amor, frenesí" (1996)
"En brazos de la mujer madura" (1997)
"¿Soy linda?" (1998)
"Plenilunio" (1999)
"Novios" (1999)
"Sobreviviré" (1999)
"Ave María" (1999)
"Asfalto" (2000)
"Silencio roto" (2001)
"Pasos de baile" (2001)
"El caballero Don Quijote" (2002)
"Trece campanadas" (2002)
"El balancín de Iván" (2002), cortometraje.
"Los abajo firmantes" (2003)
"Obaba" (2005)
"La fiesta del chivo" (2005)
"Vete de mí" (2006)
"Bordertown" (2006)
"Nadie es perfecto" (2006)
"El Greco" (2007) (post-production)
"The Anarchist's Wives" (2008) (pre-production)
Pero además de hacer cine Juan Diego forma parte del grupo de teatro independiente Nuevo Repertorio, de Madrid. También trabaja de forma habitual en la sala El Mirador, que dirige su madre. Además actuó en las siguientes obras: "Rosencrantz & Guilderstern han muerto", "Alessio", "Veinte años no es nada", "Un rufián en la escalera", "Ciudades perdidas" y "Coriolano". Debutó como dramaturgo y director de escena con la obra "El privilegio de ser perro".
En televisión trabajó en las siguientes series: El Zorro, la leyenda continúa (1990-1992), Lucrecia (1996), Augustus (2003). En 2004, también en este medio, se hizo un largometraje colectivo de protesta, llamado ¡Hay motivo!, donde él participó como director del cortometraje Doble moral.
Fue nominado en dos ocasiones: en 1996 a los Premios Goya como Mejor actor revelación por "Historias de Kronen" y en 2001, también a este galardón, como Mejor actor principal por "Plenilunio".